银屑病血热证患者治疗前后血浆代谢组学分析

　　【摘要】

　　目的

　　研究银屑病血热证患者血浆代谢表型的特征及凉血解毒汤的作用机制。

　　方法：

　　选择53例银屑病血热证患者和31例健康志愿者，采用核磁共振谱仪技术分析银屑病血热证治疗前后及健康志愿者血浆代谢产物谱，通过主成分分析法研究健康人与银屑病血热证患者之间、银屑病血热证患者经凉血解毒汤治疗前后代谢产物谱的差异。

　　结果

　　银屑病血热证患者治疗前后及健康志愿者血浆核磁共振氢谱的主成分分析结果显示，不仅银屑病血热证患者与健康对照组能够被明显区分，银屑病血热证治疗前后也能较好的分开。组间内源性代谢物的含量存在明显差异，提示银屑病血热证患者存在脂类、蛋白质、能量代谢异常及肝肾功能损害。凉血解毒汤能调节银屑病血热证患者的糖脂类代谢，使其代谢网络呈现向正常状态修复的趋势。

　　结论

　　采用代谢组学方法能较全面地反应生物体的生理病理及代谢状态，并可应用于药效评价研究。

　　【关键词】　代谢组学;模式识别;核磁共振;银屑病

　　银屑病(psoriasis)又名“牛皮癣”，传统中医称为“白疕”，是一种临床上常见的慢性炎性反应、增生性皮肤病。银屑病在自然人群中的发生率为0.1%～3.0%[1]，在中国银屑病总患病率为0.12%[2]。近年来，国内外银屑病的患病率有逐渐增多趋势。由于病程长，皮损广泛，大量脱屑，常给患者的身心健康带来严重的影响。

　　银屑病病因及发病机制尚不明了，主要与遗传、免疫、感染、代谢障碍、内分泌、精神神经等因素有关。银屑病患者代谢异常早已受到广泛关注，涉及蛋白第4期刘卫红等:银屑病血热证患者治疗前后血浆代谢组学分析质、脂类、糖类、维生素及酶类代谢异常等许多方面。代谢组学是继基因组学、蛋白质组学等之后发展起来的以探讨机体整体代谢状态为目标的新方法。通过观察生物样品中所有可测代谢物的综合表现，探讨内因或外因引起的生物体内的生理、生化变化及其生物学意义。通常采用现代分析测定方法如核磁共振(nuclearmagneticresonance，NMR)、高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)和质谱等获得生物体内小分子代谢物的丰富信息，通过模式识别等化学计量学和多元统计分析方法对生物体代谢信息进行动态、系统的测量和分析，并联系生物体内的病理生理变化，确定导致这些代谢改变的靶器官和作用位点，寻找相关的生物标志物，达到认识机体反应过程的目的[3-4]。本文以银屑病血热证患者治疗前后和正常人的血浆为研究对象，采用超导傅立叶变化核磁共振波谱仪建立其代谢指纹图谱，并结合主成分分析进行模式识别，探讨银屑病血热证患者血浆代谢表型的特征及凉血解毒汤的作用机制。

　　1　对象和方法　

　　1.1　研究对象53例病例均选自2006年6月至2008年10月期间在首都医科大学附属北京中医医院皮科门诊及住院治疗的银屑病患者。银屑病血热证符合《常见疾病的诊断与疗效判断标准》[5]中寻常型银屑病的诊断标准，且符合中医血热证诊断标准。男33例，女20例，平均年龄(36.08&viewmn;10.39)岁。选取体检正常者30例作为正常对照组，男15例，女15例，平均年龄(35.63&viewmn;8.09)岁。妊娠或准备妊娠、哺乳期妇女;对本研究药物过敏者;合并有心血管、脑血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病和精神病患者;近2周内服过类固醇药物，或受过光疗，或接受免疫抑制剂者，以往曾使用含砷药物的患者;正在使用其他外用药物治疗者均不符合纳入标准。采用凉血解毒汤治疗8周，进行治疗前后的癣区域严重度指标(psoriasisareaandseverityin-dex，PASI)评分和瘙痒程度评价以判定疗效。

　　1.2　试剂与仪器

　　1)药物与试剂:重水(D2O)，美国CambridgeIso-topeLaboratories，Inc.公司;氘代氯仿，美国CambridgeIsotopeLaboratories，Inc.公司;氘代甲醇，美国Cam-bridgeIsotopeLaboratories，Inc.公司;3-三甲基硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸钠〔2，2，3，3-D(4)-3-(trimethylsi-lyl)propionicacidsodiumsalt，TSP〕，德国Merck公司。2)仪器:美国瓦里安公司(Varian，Inc.)INOVA600MHz超导核磁共振谱仪，配备脉冲场梯度，带梯度场的三共振探头;离心机:德国Eppendorf公司MiniSpinPlus微型高速度离心机。

　　1.3　实验方法

　　1)样品配制:向编号后的EP管中分别依次加入100μL(3-三甲基硅烷基)-2，2，3，3-四氘代丙酸钠(TSP)的重水溶液(1g/L)，200μL血浆以及300μL重水(D2O)，充分震荡混匀后，13000r/min离心10min。取550μL上清加入5mm核磁共振管中待用。对血清量不足者，以重水补齐。2)NMR实验:分别对血浆样本进行驰豫编辑实验(carr-purcell-meib600-Gill，CPMG)和扩散编辑实验(LogitudsialEoddyRelay，LED)，分别观测血浆中的小分子代谢物和脂类代谢产物。所有实验的谱宽为8000Hz，采样点为32k，弛豫延迟为2s，采样时间为4s，累加次数为64次。CPMG实验的自选回拨时间(2nτ)为320ms，LED实验的扩散时间为100ms，梯度场强度为35G/m。3)NMR数据处理:对所得NMR数据经傅立叶变换得到谱图，经相位校正和基线校正之后，对一定区间内的谱图按每段0.04ppm的宽度进行分段积分，其中CPMG数据积分范围为δ0.4～4.4;LED数据积分范围为0.1～6.0，并将4.62～5.1段排除。

　　1.4　数据分析

　　将所有积分数据输出到Excel文件保存，然后输入到SIMCA-P+软件(v10.04，Umetrics，Umea，Swe-den)进行分析。数据采用Pareto标度化(Paretoscal-ing)进行预处理之后采用主成分分析(priaciplecomp-aonentanalysis，PCA)分析。结果以得分图和载荷图表示。为扩大组间差异，消除无关因素影响，进一步采用正交信号校正(orthogonalsignalcorrection，OSC)方法进行预处理，然后再进行偏最小二乘判别分析(pattialleastsquaredisurimientanalysis，PLS-DA)。

　　2　结果

　　2.1　银屑病血热证患者与健康志愿者血浆1HNMR谱模式识别分析银屑病血热证患者与健康志愿者的血浆样本经431首都医科大学学报第30卷弛豫编辑实验和扩散编辑实验，其中弛豫编辑谱主要包括血浆中的小分子代谢物，如葡萄糖、氨基酸、其他有机酸以及胆碱等，而扩散编辑谱则主要包含来自于脂蛋白中的脂肪酸的信号。1)驰豫编辑实验结果:银屑病血热证患者治疗前后与健康志愿者血浆的CPMG1HNMR谱的PLS-DA分析结果见图1。从得分图可见银屑病血热证患者治疗前后2组样本沿红线方向与正常组有明显的分组差异，且差异一致。2)扩散编辑实验结果:银屑病血热证患者治疗前后与健康志愿者血浆的LED1HNMR谱的PLS-A分析结果见图2。从得分图可以看到，银屑病血热证患者治疗前后两组样本沿重点主成分t[1]轴方向与正常组存在明显的分组差异，其中，治疗后较治疗前略接近正常组，但差异很小。样本间的主要差异物质见表2。

　　2.2　银屑病血热证患者治疗前后血浆1HNMR谱模式识别分析1)驰豫编辑实验结果:银屑病血热证患者治疗前与治疗后血浆的CPMG1HNMR谱的OSCPLS分析结果见图3。从得分图上看治疗前、后2组样本间沿t[1]轴方向能较好的分开，各组内样本间沿t[2]轴分散，表明t[1]轴方向表现了组间差异，而t[2]轴显示为组内差异即个体差异。从因子载荷图上看，与治疗前相比，血热证患者治疗后血样中0.9、1.26和1.3(主要为血脂)、2.06(糖蛋白)及3～4之间的葡萄糖的含量有所下降。2)扩散编辑实验结果:银屑病血热证患者治疗前与治疗后血浆的LED1HNMR谱的OSCPLS分析结果见图4。从得分图中可以看出，治疗前后2组患者间沿红线较好分开。结合因子载荷图分析，与治疗前相比，血热证患者治疗后样本中0.9(极低密度脂蛋白VLDL)，0.86和1.26(低密度脂蛋白，LDL)，2.74(不饱和脂肪酸)，3.26(磷脂酰胆碱)的含量有所下降

　　3　讨论

　　银屑病是一种由多基因遗传决定的、多环境因素刺激诱导的免疫异常性慢性炎性反应性增生性皮肤病。其发病的始动触发因素仍不清楚，发病涉及多个环节。近年来，血脂在银屑病患者中的代谢异常已引起人们的普遍关注，血脂及载脂蛋白异常引起的内皮细胞损伤，与银屑病的发病及病情轻重有关。国内外研究[6-8]均已证实，银屑病患者常伴有脂代谢紊乱。若对纷繁复杂的代谢物进行检测，需从总体上关注代谢物的变化，但传统的检测方法却难以达到此目的，而系统生物学的研究方法之一代谢组学则显示了传统研究方法所无法比拟的优越性。代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后，系统生物学的重要组成领域[9]。是一门在新陈代谢的动态进程中，系统研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质的科学。它通过分析机体生物液体和组织中代谢产物谱的变化，研究机体整体生物学状况和功能调节;应用化学计量学计算机程序分析代谢谱图，快速反映生物体对环境和基因变化的响应，探测出异常的信号模式，所提供的信息有助于了解生物系统调控网络中各种复杂的相互作用。本研究运用代谢组学技术，观察银屑病血热证患者血浆代谢表型的特征。代谢组学的结果不仅显示银屑病血热证患者与健康对照组能够被明显区分，银屑病血热证治疗前后也能较好的分开。组间内源性代谢物的含量存在明显差异，提示银屑病血热证的相关生物代谢通路发生了改变。本研究结果表明，代谢产物谱有明显的分组差异，即银屑病血热证患者与健康对照之间代谢产物存在明显的不同。从1HNMR图谱及模式识别分析发现:1)与健康对照组比较，银屑病血热证患者血浆中极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、脂肪酸及不饱和脂肪酸均明显增高，且3-羟基丁酸、丙酮、乳酸等脂代谢重要的中间产物亦明显增高，表明银屑病血热证患存在明显的脂代谢紊乱;2)与健康对照组比较，银屑病血热证患者血浆中缬氨酸、谷氨酰胺含量增高。谷氨酰胺是氨的主要运输形式。血浆氨基酸主要反映肝细胞的代谢状态，肝脏与氨基酸代谢关系极为密切。王晓华等[10]的研究显示银屑病患者血浆芳香族氨基酸(包括苯丙氨酸、酪氨酸)、支链氨基酸(包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)及天门冬氨酸、赖氨酸高于正常人，而甘氨酸、苏氨酸低于正常人。提示银屑病血热证患者存在蛋白代谢障碍;3)在1HNMR图谱中可以发现银屑病血热证患者血浆中乙酸、肌酸、胆碱等的谱峰强度改变较为明显。乙酸的代谢异常是肝功能损伤的标志;肌酸是尿中主要非蛋白氮代谢产物之一，其含量与肾功能正常与否关系密切，可作为肾病的标志物之一;胆碱是一种维生素类化合物，它对细胞膜完整性及脂类消化运输发挥重要作用。整合这些资料提示银屑病血热证患者不仅脂代谢和蛋白代谢紊乱，并存在肝肾功能的损害。传统中医药治疗银屑病有着悠久的历史和较大的优势。当代医家赵炳南、张志礼、朱仁康、金起凤、欧阳恒、马绍尧等在治疗银屑病研究方面有独到的认识和突出的疗效。　

　　本研究总结了北京地区著名皮科医生赵炳南、金起凤、朱仁康、张志礼等治疗寻常型银屑病的辨证特点及用药，虽然各位医生的学术渊源不同，但都提出了“从血论治”的观点11]，尤其对该病的进行期都认识到血热病机的突出地位[12]。治疗银屑病进行期均以凉血活血、清热解毒为基本法则。本研究总结提炼出北京地区名老中医对血热证的辨证要点及经验方药，将该方药命名为“凉血解毒汤”。银屑病血热证患者治疗后皮损的PASI评分较治疗前明显降低，总有效率为76.5%。本研究结果显示，银屑病血热证患者治疗后较治疗前略接近正常组，表明凉血解毒汤对银屑病血热证代谢异常产生了有效的干预作用。分析治疗前、后组间代谢产物的差异可知，治疗后血浆中VLDL、LDL、不饱和脂肪酸和葡萄糖含量均有所下降。说明凉血解毒汤对银屑病血热证糖脂代谢的紊乱具有一定的调整作用。从代谢组学角度来看，银屑病血热证患者存在脂类、蛋白质、能量代谢异常及肝肾功能损害。凉血解毒汤能调节银屑病血热证患者的糖脂类代谢，使之代谢网络呈现向正常状态修复的趋势，这可能是凉血解毒汤治疗银屑病血热证的作用机制。

　　4　参考文献

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